Enzymologie en milieu complexe

Enzymology in a complex medium

🇫🇷 La fixation du CO₂ dans le cycle de Calvin-Benson-Bassham est réalisée par la RuBisCO, qui, chez les diatomées a un Km de 23 à 65 μM pour le CO₂. Or la concentration de ce dernier dans les milieux aquatiques est inférieure à ces valeurs. Pour pallier cette difficulté, les microalgues possèdent des mécanismes de concentration du CO₂ (CCM) qui augmentent la concentration de CO₂ au voisinage du site actif de la RuBisCO. Nous nous intéressons à ces CCMs, en particulier chez les diatomées. Nous avons récemment identifié une nouvelle classe d’anhydrase carbonique: l’anhydrase carbonique iota (ι-CA) chez une diatomée marine, Thalasiossira pseudonana. ι-CA presente plusieurs specificités: son activité catalytique pour la conversion CO₂ ↔ HCO₃^– n’est pas dépendante du Zn²⁺; elle est fonctionnelle en absence de métal ou en présence de Mn²⁺; elle oligomérise dans une forme atypique de drone.

Par ailleurs, nous avons aussi identifié des protéines plus abondantes en condition de faible concentration de CO₂ (50 ppm or 400 ppm) vs high concentration (20 000ppm) chez T. pseudonana, notamment une protéine homologue à la CP12 (Thaps-CP12).

🇬🇧 The fixation of CO₂ in the Calvin-Benson-Bassham (CBB) cycle is performed by the RuBisCO that has a Km for CO₂ of 23 to 65 μM in diatoms. Since in aquatic environment, the CO₂ concentration is lower than these values, microalgae have evolved CO₂ concentrating mechanisms (CCM) that increase the local CO₂ concentration nearby the RuBisCO active site. We are interested in the CCM especially from diatoms. Recently, we have identified a new class of carbonic anhydrase, the iota carbonic anhydrase (ι-CA) that participates to the biophysical CCM of a marine diatom, Thalassiosira pseudonana. ι-CA presents unique specificities in its catalysis of CO₂ ↔ HCO₃^– conversion: it does not require Zn²⁺; can work either independently of metal or with Mn²⁺; it oligomerises in an atypical drone-like shape.

Besides, we have identified proteins that are more abundant in low-CO₂ conditions (50 or 400 ppm) vs high concentration (20 000 ppm), in the marine diatom T. pseudonana. In particular, we have identified a protein homologous to CP12 (Thaps-CP12).

Le carbone inorganique est métabolisé notamment par le cycle de Calvin-Benson-Bassham (CBB) dans le chloroplaste. Lors de la transition de la lumière à l’obscurité, les enzymes du cycle CBB sont très rapidement inhibées, elles sont aussi très rapidement activées lors de la transition de l’obscurité à la lumière. Cette régulation dépend des conditions redox du chloroplaste ainsi que d’autre facteurs comme le pH chez les algues vertes et les plantes supérieures, mais est différente chez les diatomées. Nous nous intéressons à la régulation d’enzymes du CBB chez les diatomées car elle est peu étudiée. Nous nous intéressons particulièrement aux changements de conformation des protéines responsables de cette régulation rapide, dont certaines sont des protéines intrinsèquement désordonnées.

Notamment, la protéine CP12 est une protéine conditionnellement désordonnée, qui se replie partiellement selon les conditions redox. Dans son état oxydé et partiellement replié, la CP12 associe deux enzymes du cycle CBB dans un complexe ternaire (la GAPDH et la PRK), où elles sont inactives. Nous étudions ces transitions structurales dans des conditions physiologiques.

The inorganic carbon is assimilated mainly by the Calvin-Benson-Bassham (CBB) cycle in the chloroplast. Upon light-to-dark transition, the CBB enzymes are rapidily inhibited, and they are rapidly activated upon dark-to-light transition. This very efficient regulation depends upon the redox conditions within the chloroplast as well as other factors such as pH in the Plantae, but differs in the diatoms. We are studying the CBB enzyme regulation in diatoms for which only few data are available. We are notably studying the conformational transitions of regulatory proteins that are responsible for this efficient regulation, many of which are intrinsically disordered proteins. 

In particular, the CP12 protein is a conditionnally redox-dependant disordered protein, that is partially folded when oxidized. In this oxidized state, CP12 associates two CBB enzymes in a ternary complex (PRK and GAPDH) in which they are inactive. We are studying the structural transitions of CP12 in physiological conditions.

Chez les diatomées, les principaux composés de réserve sont les lipides neutres (comme les triacylglycérols, TAGs) et les glucides (chrysolaminarine). Leur accumulation dépend des conditions environnementales, et est souvent déclenchée par des conditions de stress, telles qu’une diminution en nutriments. Puisque la biosynthèse des composés de réserve dépend également du CO₂, nous étudions l’effet de sa concentration au niveau des protéines, ainsi que sur les composés de réserve chez de nombreuses diatomées. Le stockage des acides gras dans les TAGs étant inversement correlé à la croissance cellulaire et à la biogénèse des membranes, nous nous intéressons à la distribution des acides gras entre les TAGs et les principaux lipides membranaires, les galactolipides, et aux enzymes lipolytiques (lipases et galactolipases) impliquées dans la mobilisation des acides gras.

Nous visons également à générer des connaissances fondamentales sur la façon dont deux voies de signalisation du stress et de l’énergie (inhibiteurs de « Target of rapamycin » TOR et ppGpp, un deuxième messager bien connu pour induire un stress chez les bactéries) intègrent les signaux du chloroplaste et du cytosol pour réguler croissance et accumulation de TAG. Nous avons étudié l’effet des inhibiteurs de TOR chez T. pseudonana et étudions actuellement le ppGpp et les enzymes qui le synthétisent ou l’hydrolyse chez Phaeodactylum tricornutum.

In diatoms, the main storage (or reserve) compounds are neutral lipids (as triacylglycerol,TAG) and the carbohydrate (chrysolaminarin), Their accumulation depends on the environmental conditions, often triggered by stress conditions, such as nutrient limitation. Since biosynthesis of reserve compounds also depends on CO₂ we are studying the effect of CO₂ concentration at the level of proteins, as well as on reserve compounds in many diatoms. Since the storage of fatty acids in TAGs is conversely correlated with cellular growth and membrane biogenesis, we are interested in the distribution of fatty acids between TAGs and the main membrane lipids, galactolipids, and by lipolytic enzymes (lipases and galactolipases) involved in fatty acid mobilization.

We also aim to generate fundamental knowledge on how two major stress and energy signaling pathways (target of rapamycin (TOR) inhibitors and ppGpp, a second messenger well-known to induce stress in bacteria) integrate signals from the chloroplast and the cytosol to regulate the balance between growth and TAG accumulation. We have studied the effect of TOR inhibitors in T. pseudonana and are currently studying ppGpp in Phaeodactylum tricornutum.